Методы секвенирования второго поколения (NGS) предполагает использование как амплификации, так и методов таргетного захвата с использованием зондов для избирательного выделения целевых участков генома. Этот метод позволяет детектировать специфические последовательности, при этом сохраняя фрагменты ДНК в их исходном виде, что особенно важно при исследовании крупных и сложных геномных вариаций. В отличие от амплификации, где анализируемые области генома ограничиваются выбранными праймерами, зонды обеспечивают гибкость в выборе целевых участков и подходят для анализа протяжённых последовательностей.
Зонды представляют собой синтетические одноцепочечные молекулы ДНК-, комплементарные целевым участкам ДНК, которые используются для гибридизации с интересующими последовательностями генома. Эти зонды часто модифицированы биотином, что позволяет отделить захваченные фрагменты от общего пула ДНК с помощью имобилизации на магнитных частицах, покрытых стрептавидином. Процесс захвата обеспечивает возможность целенаправленного выделения интересующих областей генома и создания высоко специфичных таргетных панелей.
В отличие от амплификации, зонды дают возможность исследовать крупные области генома, что делает их оптимальным инструментом для задач, требующих охвата больших сегментов ДНК, таких как анализ экзома или выявление структурных вариаций.
Зонды представляют собой синтетические одноцепочечные молекулы ДНК-, комплементарные целевым участкам ДНК, которые используются для гибридизации с интересующими последовательностями генома. Эти зонды часто модифицированы биотином, что позволяет отделить захваченные фрагменты от общего пула ДНК с помощью имобилизации на магнитных частицах, покрытых стрептавидином. Процесс захвата обеспечивает возможность целенаправленного выделения интересующих областей генома и создания высоко специфичных таргетных панелей.
В отличие от амплификации, зонды дают возможность исследовать крупные области генома, что делает их оптимальным инструментом для задач, требующих охвата больших сегментов ДНК, таких как анализ экзома или выявление структурных вариаций.
Преимущества зондового обогащения
🔹Гибкость и широта охвата
Захват с использованием зондов позволяет работать с обширными геномными участками, такими как гены или экзоны, а также получать более детальную информацию при работе с протяжёнными последовательностями.
🔹Минимизация полимеразных ошибок
Метод не требует ПЦР на этапе обогащения, что исключает вероятность ошибок полимеразы и повышает точность анализа.
🔹Улучшенная чувствительность к низкочастотным вариантам
Зонды позволяют детектировать редкие генетические вариации, которые могут теряться в процессе амплификации, что особенно актуально для онкологических исследований и анализа гетерогенных образцов.
🔹Снижение зависимости от вариабельности в области связывания
Генетические полиморфизмы, расположенные в местах связывания зондов, менее критично влияют на процесс, что позволяет получать стабильные результаты даже на высокополиморфных участках генома.
Ограничения и недостатки зондового обогащения
🔸Требования к качеству и количеству ДНК
Метод требует наличия высококачественной и достаточной по количеству ДНК, что может затруднять его применение на ограниченных или деградированных образцах.
🔸Высокая стоимость
Синтез зондов и разработка панелей для обогащения требуют значительных ресурсов, что делает метод более дорогостоящим по сравнению с амплификационным подходом.
🔸Сложности при мультиплексировании
Большое количество зондов в одной панели может привести к неспецифической гибридизации и снижению эффективности захвата, что требует точной оптимизации условий.
🔸Ограничения по длине фрагментов
Зонды лучше работают с длинными фрагментами ДНК, поэтому для малых фрагментов может потребоваться дополнительная адаптация или альтернативные методы обогащения.
🔹Гибкость и широта охвата
Захват с использованием зондов позволяет работать с обширными геномными участками, такими как гены или экзоны, а также получать более детальную информацию при работе с протяжёнными последовательностями.
🔹Минимизация полимеразных ошибок
Метод не требует ПЦР на этапе обогащения, что исключает вероятность ошибок полимеразы и повышает точность анализа.
🔹Улучшенная чувствительность к низкочастотным вариантам
Зонды позволяют детектировать редкие генетические вариации, которые могут теряться в процессе амплификации, что особенно актуально для онкологических исследований и анализа гетерогенных образцов.
🔹Снижение зависимости от вариабельности в области связывания
Генетические полиморфизмы, расположенные в местах связывания зондов, менее критично влияют на процесс, что позволяет получать стабильные результаты даже на высокополиморфных участках генома.
Ограничения и недостатки зондового обогащения
🔸Требования к качеству и количеству ДНК
Метод требует наличия высококачественной и достаточной по количеству ДНК, что может затруднять его применение на ограниченных или деградированных образцах.
🔸Высокая стоимость
Синтез зондов и разработка панелей для обогащения требуют значительных ресурсов, что делает метод более дорогостоящим по сравнению с амплификационным подходом.
🔸Сложности при мультиплексировании
Большое количество зондов в одной панели может привести к неспецифической гибридизации и снижению эффективности захвата, что требует точной оптимизации условий.
🔸Ограничения по длине фрагментов
Зонды лучше работают с длинными фрагментами ДНК, поэтому для малых фрагментов может потребоваться дополнительная адаптация или альтернативные методы обогащения.
Зонды для таргетного секвенирования представляют собой высокоэффективный инструмент, позволяющий проводить анализ значительных участков генома, включая сложные структурные вариации. Этот подход обеспечивает высокую специфичность и чувствительность при работе с редкими генетическими вариантами, что делает его незаменимым для диагностических и исследовательских задач, таких как выявление онкогенных мутаций и редких наследственных заболеваний. При оптимизации условий гибридизации и правильном подборе панелей захват с использованием зондов становится мощным и гибким методом для глубокой молекулярной диагностики.