Второе поколение методов секвенирования (NGS) работает с так называемыми короткими прочтениями, что требует предварительного разбиения длинных молекул ДНК на более мелкие фрагменты размером от нескольких десятков до сотен пар оснований. После секвенирования эти фрагменты собираются в исходную последовательность с помощью биоинформатических алгоритмов. Для получения фрагментов нужного размера используются два метода — фрагментация и амплификация. Рассмотрим первый из них.
Фрагментация ДНК — один из ключевых этапов подготовки библиотек для секвенирования нового поколения (NGS). Фрагментация позволяет разбить длинные молекулы ДНК на фрагменты определённого размера, обеспечивая равномерное покрытие генома и минимизируя искажения. В настоящее время для фрагментации применяются два основных подхода: физические методы и ферментативные методы. Оба варианта имеют свои достоинства и ограничения, и их выбор зависит от цели исследования, особенностей ДНК и доступных ресурсов.
ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК
Физические методы основаны на механическом воздействии на молекулы ДНК, что приводит к их разрушению. Среди них наиболее распространённые:
🔹Сонификация
Ультразвуковое воздействие, разрывающее молекулы ДНК посредством акустических волн.
🔹Небулизация
Фрагментация путём пропускания ДНК через мелкие отверстия под высоким давлением.
🔹Гидродинамическая фрагментация
Метод, при котором молекулы ДНК разрушаются в условиях интенсивного потока жидкости.
Преимущества физических методов:
Отсутствие необходимости в специфических реагентах: физические методы не требуют ферментов или химических добавок, что снижает зависимость от качества реагентов.
Воспроизводимость результатов: при правильной настройке физические методы позволяют получить фрагменты с относительно однородными размерами.
Интеграция в автоматизированные рабочие процессы: физические методы легко адаптируются к роботизированным системам для высокопроизводительных исследований.
Ограничения физических методов:
Риск повреждения ДНК: физическое воздействие может привести к разрывам молекул и повреждению вторичной структуры, что особенно критично для исследований, требующих высокой точности.
Необходимость в специализированном оборудовании: такие методы требуют дорогих ультразвуковых или гидродинамических устройств, что может увеличить издержки.
Сложность масштабирования: большинство приборов работают с единичными образцами либо небольшими группами, и требуют перерывов в работе для охлаждения. Фрагментация потока образцов может занимать продолжительное время.
Физические методы основаны на механическом воздействии на молекулы ДНК, что приводит к их разрушению. Среди них наиболее распространённые:
🔹Сонификация
Ультразвуковое воздействие, разрывающее молекулы ДНК посредством акустических волн.
🔹Небулизация
Фрагментация путём пропускания ДНК через мелкие отверстия под высоким давлением.
🔹Гидродинамическая фрагментация
Метод, при котором молекулы ДНК разрушаются в условиях интенсивного потока жидкости.
Преимущества физических методов:
Отсутствие необходимости в специфических реагентах: физические методы не требуют ферментов или химических добавок, что снижает зависимость от качества реагентов.
Воспроизводимость результатов: при правильной настройке физические методы позволяют получить фрагменты с относительно однородными размерами.
Интеграция в автоматизированные рабочие процессы: физические методы легко адаптируются к роботизированным системам для высокопроизводительных исследований.
Ограничения физических методов:
Риск повреждения ДНК: физическое воздействие может привести к разрывам молекул и повреждению вторичной структуры, что особенно критично для исследований, требующих высокой точности.
Необходимость в специализированном оборудовании: такие методы требуют дорогих ультразвуковых или гидродинамических устройств, что может увеличить издержки.
Сложность масштабирования: большинство приборов работают с единичными образцами либо небольшими группами, и требуют перерывов в работе для охлаждения. Фрагментация потока образцов может занимать продолжительное время.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК
Ферментативная фрагментация основана на использовании ферментов для направленного разрыва молекул ДНК. Эти методы всё больше востребованы благодаря своей точности и предсказуемости. Основные подходы:
🔸ДНКазы
Ферменты, которые случайным образом разрушают молекулы ДНК.
🔸Транспозазы
Ферменты, которые одновременно фрагментируют ДНК и интегрируют адаптеры для секвенирования (например, технология Nextera).
Преимущества ферментативных методов:
Простое масштабирование работы: ферментативные методы легко справляются с потоковой работой, поскольку обработка любого количества образцов идет единовременно.
Снижение риска повреждения ДНК: ферментативные методы действуют более мягко, снижая вероятность нежелательных разрывов и структурных нарушений.
Оптимизация рабочего процесса: некоторые ферменты (например, транспозазы) позволяют не только фрагментировать ДНК, но и сразу интегрировать адаптеры, что значительно упрощает подготовку библиотек.
Ограничения ферментативных методов:
Высокая стоимость реагентов: ферментативные методы требуют качественных ферментов и буферов, что может повысить стоимость эксперимента.
Чувствительность к последовательностям: необходимо использовать ферменты, для которых показано отсутствие избирательности в отношении определенных участков или последовательностей ДНК.
Зависимость от условий реакции: активность ферментов может варьироваться в зависимости от качества реагентов и условий хранения, что требует строгого контроля условий эксперимента.
Ферментативная фрагментация основана на использовании ферментов для направленного разрыва молекул ДНК. Эти методы всё больше востребованы благодаря своей точности и предсказуемости. Основные подходы:
🔸ДНКазы
Ферменты, которые случайным образом разрушают молекулы ДНК.
🔸Транспозазы
Ферменты, которые одновременно фрагментируют ДНК и интегрируют адаптеры для секвенирования (например, технология Nextera).
Преимущества ферментативных методов:
Простое масштабирование работы: ферментативные методы легко справляются с потоковой работой, поскольку обработка любого количества образцов идет единовременно.
Снижение риска повреждения ДНК: ферментативные методы действуют более мягко, снижая вероятность нежелательных разрывов и структурных нарушений.
Оптимизация рабочего процесса: некоторые ферменты (например, транспозазы) позволяют не только фрагментировать ДНК, но и сразу интегрировать адаптеры, что значительно упрощает подготовку библиотек.
Ограничения ферментативных методов:
Высокая стоимость реагентов: ферментативные методы требуют качественных ферментов и буферов, что может повысить стоимость эксперимента.
Чувствительность к последовательностям: необходимо использовать ферменты, для которых показано отсутствие избирательности в отношении определенных участков или последовательностей ДНК.
Зависимость от условий реакции: активность ферментов может варьироваться в зависимости от качества реагентов и условий хранения, что требует строгого контроля условий эксперимента.
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ
Для выбора оптимального метода фрагментации необходимо учитывать ряд факторов, таких как размер целевых фрагментов, характер исследуемой ДНК, доступное оборудование и бюджет. В таблице ниже представлены основные параметры для сравнения физических и ферментативных методов.
Для выбора оптимального метода фрагментации необходимо учитывать ряд факторов, таких как размер целевых фрагментов, характер исследуемой ДНК, доступное оборудование и бюджет. В таблице ниже представлены основные параметры для сравнения физических и ферментативных методов.
Оптимальный выбор метода фрагментации зависит от задач исследования. Если требуется высокая скорость и предсказуемость, ферментативные методы, особенно транспозазы, являются предпочтительным выбором, так как они обеспечивают точный контроль над длиной фрагментов и ускоряют процесс подготовки библиотек. В условиях ограниченного бюджета и при наличии необходимого оборудования физические методы могут быть более экономичным вариантом, однако требуют более тщательной оптимизации протоколов.
В полногеномной пробоподготовке от Парсек Лаб Prep&Seq™ G-fragmentation используется ферментативная фрагментация, которая обеспечивает независимость пользователя от специального оборудования и является легко масштабируемой методикой.
В полногеномной пробоподготовке от Парсек Лаб Prep&Seq™ G-fragmentation используется ферментативная фрагментация, которая обеспечивает независимость пользователя от специального оборудования и является легко масштабируемой методикой.