Рассмотрим важный параметр дизайна — длину прочтения. От выбранной длины прочтения зависит последующая длина ампликона в дизайне панели, а этот выбор определяется рядом факторов:
Качество входного биоматериала ДНК может быть в значительной мере фрагментирована и/или модифицирована, если выделена из FFPE блоков, из плазмы (cfDNA), из палеонтологических образцов, зачастую из криминалистических образцов. При работе с такими препаратами ДНК можно рассчитывать на прочтения не более 150 нуклеотидов. Если ДНК выделена из венозной крови, лейкоцитарной массы, пятен сухой крови, буккального эпителия, то она имеет, скорее всего, достаточно высокую целостность, что допускает увеличение длины прочтения вплоть до 400 нуклеотидов.
Необходимость совмещать запуски секвенирования с какими-либо другими панелями Если есть такая потребность, то новую панель следует разрабатывать таким образом, чтобы длины прочтений не отличались от тех, которые уже разработаны для других панелей, параллельно используемых в лаборатории.
Доступные реагенты для ваших секвенаторов При выборе длин прочтений необходимо ориентироваться на используемые в лаборатории реагенты для секвенирования (или доступные для приобретения и совместимые с секвенатором).
Необходимость детектировать делеции или инсерции Общее правило гласит, что успешно детектируются делеции и инсерции, составляющие до одной третьей длины прочтения. Это правило имеет ряд нюансов, связанных с расположением варианта внутри прочтения, а также с применяемыми алгоритмами анализа. Однако, эти нюансы не исключают закономерности – чем длиннее прочтение, тем вероятнее детекция протяженного варианта.
Необходимость в покрытии участков генома, имеющие гомологию В случае, если регион интереса имеет неполный гомолог в геноме, прочтения, пришедшие с гомолога и целевого региона возможно различить по различиям внутри прочтений и однозначно выровнять на геном. Чем длиннее прочтение, тем вероятнее, что разница найдется.
В пользу решения об увеличении длины прочтения говорит:
🔸Необходимость детектировать случайные делеции или инсерции;
🔸Необходимость секвенировать регион, имеющий гомологию в геноме;
🔸Стремление снизить цену на панель, поскольку для покрытия участка длинных прочтений требуется меньше, чем коротких.
Однако, в любом случае, следует придерживаться правила: размер ампликона не должен превышать длину прочтения! В противном случае возникает StrandBias, о котором мы говорили ранее.