Второе поколение методов секвенирования (NGS) использует короткие прочтения, поэтому длинные молекулы ДНК предварительно разбивают на фрагменты размером от десятков до сотен пар оснований. После секвенирования эти фрагменты собираются в исходную последовательность с помощью биоинформатических алгоритмов. Для создания фрагментов нужного размера применяются два метода — фрагментация и амплификация. Рассмотрим второй из них.
Получение фрагментов необходимого размера для секвенирования достигается подбором пары праймеров, которые отжигаются на участки генома на определенном расстоянии друг от друга. Такой подход позволяет одновременно таргетировать нужные области генома и получать фрагменты – ампликоны. Поэтому амплификационные библиотеки по своей природе являются таргетными. В отличие от фрагментации, где разрывы ДНК носят случайный характер, амплификация позволяет создавать заданные фрагменты. Прочтения с ампликонов выравниваются на референсные последовательности строго на определенные участки, что повышает точность. Специфичность процесса зависит от специфичности ПЦР, лежащей в основе метода.
Ключевым этапом создания амплификационных библиотек является таргетная ПЦР, определяющая как преимущества, так и недостатки этого подхода.
Преимущества амплификационного обогащения
🔹Высокая специфичность Пара праймеров может быть подобрана так, что будет нарабатываться только уникальный ампликон со всей последовательности генома.
🔹Высокая чувствительность При амплификационном подходе ПЦР обогащение является первым этапом пробоподготовки, что позволяет нарабатывать целевые фрагменты со всей ДНК, что позволяет работать с проблемным материалом и низкими концентрациями.
🔹Упрощение работы с РНК Реакцию обратной транскрипции можно совмещать с ПЦР в одной пробирке, что позволяет минимизировать число этапов в протоколе пробоподготовки.
Недостатки амплификационного обогащения
🔸Ошибки полимераз На этапе элонгации ПЦР возможно внесение ошибок в синтезируемые фрагменты. Современные полимеразы работают с высокой точностью, но полностью избежать ошибок невозможно.
🔸Выпадение аллелей Генетические варианты в местах посадки праймеров могут снижать эффективность ПЦР или даже приводить к ее отсутствию. Парсек Лаб учитывает частоту генетических вариантов из баз данных GnomAD, dbSNP, что помогает избегать посадки праймеров к вариабельным участкам генома.
🔸Сложности мультиплексирования Чем больше праймеров включено в панель, тем выше вероятность негативных эффектов: неспецифической амплификации, разной эффективности, сложности балансировки термодинамических свойств и конкуренции.
🔸ПЦР-дубликаты Все прочтения одного ампликона являются дубликатами, что ограничивает чувствительность метода при использовании уникальных молекулярных идентификаторов (UMI).
Амплификационное обогащение идеально подходит для создания высокоспецифичных панелей, эффективно работающих с материалами разного качества и широким диапазоном концентраций. Правильный подход к дизайну и использование проверенных реагентов помогают минимизировать возможные проблемы.